Para determinar ciertos patógenos por esta técnica se selecciona una secuencia específica de ADN del mismo, que no presenta similitud de secuencia con otros microorganismos, para que la reacción de detección sea específica. Como ventajas pueden mencionarse: sensibilidad, especificidad y rapidez de diagnóstico. Se denomina PCR en tiempo real porque se visualiza en tiempo real en un equipo la fluorescencia emitida por la amplificación del gen target (secuencia especifica) en aquellas muestras positivas.
Para la detección de la fluorescencia, es necesario la utilización de una molécula fluorescente, que puede unirse específica o inespecíficamente al producto amplificado.
Los agentes intercalantes como SYBR Green se unen inespecíficamente a la doble hebra de ADN. Si está presente la secuencia target, la amplificación de esta secuencia en cada ciclo es detectada con la emisión de fluorescencia en tiempo real, generando una curva de amplificación con un valor de Ct o ciclo umbral característico (Figura 3 A). Se denomina Ciclo Umbral o Ct al ciclo en el cual la curva de amplificación supera una línea de corte, definida por el software del equipo utilizado. Los valores de Ct dependerán- entre otros factores-del número de copias de la secuencia target.
La utilización de agentes intercalantes permiten evaluar con curvas de disociación, la presencia de productos inespecíficos como dimeros de primers u otros productos. Con el análisis de curvas de disociación, el software grafica el cambio en la emisión de fluorescencia (RFU) respecto al aumento gradual de temperatura. El pico de la curva corresponde a la temperatura en la cual la mitad de las moléculas de ADN doble cadena están asociadas a Syber Green, y la otra mitad de moléculas está disociada del ADN de cadena simple. (figura 3B)
Fig.3 A. Curvas de amplificación en tiempo real para cada muestra analizada. En el eje X figuran los ciclos de amplificación mientras que en el eje Y se grafìca la intensidad de fluorescencia denominada RFU. Figura 3B. Se observan las curvas de Melting o disociación, donde el software del equipo grafìca la derivada de RFU en función de la temperatura (eje Y) vs la temperatura. El pico corresponde a la temperatura donde la mitad de las moléculas de ADN se encuentran asociadas al fluorósforo.
La Tm o temperatura de disociación es única para cada producto amplificado y depende de la longitud del producto, contenido GC y posibles mistmatches.
El análisis de las curvas de amplificación y disociación permitirán definir el resultado para cada muestra procesada. Los valores de Ct serán evaluados como una medida relativa de la concentración de la secuencia target. Mientras que La Tm de las muestras positivas tendrán que coincidir con la Tm de la muestra control, previamente confirmada como control positivo.